ヒストンH3の27番目のリジン残基の脱メチル化酵素KDM6A(UTX)は、固形腫瘍や種々の造血器腫瘍で機能欠失変異が数多く見出されている。UTXの正常造血と造血器腫瘍発症におけるUTXの役割を明らかにする目的で後天的にUTXを欠失したマウスを作製した。UTX欠失マウスは、末梢血中の骨髄球とよばれる細胞が増加しており、種々の血液細胞で異型成が認められた（図1A）。また、骨髄以外には通常存在しない造血幹細胞がUTX欠失マウスでは脾臓や末梢血で数多く存在しており、骨髄以外での造血である髄外造血が起こっていることが示された（図1B）。さらに、マウスに白血病を誘導するウイルスを感染させたところ、コントロールマウスに比較してUTX欠失マウスは短期間で全てのマウスが白血病を発症し、UTX欠失は白血病発症感受性を亢進させることが明らかになった（図1C）。さらに、コントロールマウスとUTX欠失マウスから造血幹細胞を単離し放射線を照射した同系マウスに移植したところ、UTX欠失造血幹細胞は造血を再構成する機能である骨髄再構築能が低下していることが示された（図1D）。UTX欠失マウスに認められた骨髄球の増加、血球の異型成、髄外造血、白血病発症感受性の亢進、骨髄再構築能の低下は、老化した血液細胞に特徴的な表現型として知られる。そこで、UTX欠失による造血幹細胞における遺伝子発現変化と、生理的な加齢により老化した造血幹細胞における遺伝子発現変化を比較したところ、両者の発現変化には有意な相関を認め、UTX欠失は表現型のみでなく遺伝子発現も老化に誘導することが明らかになった。さらにUTX欠失造血幹細胞は、細胞表面抗原発現変化や、活性酸素種の蓄積や、DNA損傷に対する応答性の遅延など、これまで老化した造血幹細胞で報告されている変化を呈するも示された。次にUTXがその脱メチル化活性によってどの遺伝子の発現を制御しているかを検証するため、UTX欠失造血幹細胞のヒストンメチル化状態の網羅的な解析を行い、その結果と遺伝子発現パターンを組み合わせた解析を行った。その結果、UTXによるヒストン脱メチル化によってTGF-βシグナリングに関連する遺伝子の発現が制御されていることが明らかとなった。その一方で、その他の老化関連遺伝子はUTXのヒストン脱メチル化によって制御されている証拠は得られなかった。UTXはそのヒストン脱メチル化活性以外にも、ヒストンメチル化を行うCOMPASS-like 複合体やヒストンの開閉状態を制御するSWI/SNF複合体といったエピジェネティックな発現制御を行う複合体の構成因子として遺伝子発現制御に関わることが知られている。そこで、既存のNGSデータを利用して解析を行った結果、老化関連遺伝子群の多くはCOMPASS-like複合体やSWI-SNF複合体の制御下にある可能性が示された。以上の結果は、UTXはその脱メチル化活性依存的、非依存的な発現制御機構の両方を介して、老化関連遺伝子群の発現を制御することで造血幹細胞の維持に貢献していることを強く示唆している（図2）。

Publication
UTX maintains the functional integrity of the murine hematopoietic system by globally regulating aging-associated genes.
Blood.2021 Feb 18;137(7):908-922. doi: 10.1182/blood.2019001044.
Sera Y, Nakata Y, Ueda T, Yamasaki N, Koide S, Kobayashi H, Ikeda KI, Kobatake K, Iwasaki M, Oda H, Wolff L, Kanai A, Nagamachi A, Inaba T, Sotomaru Y, Ichinohe T, Koizumi M, Miyakawa Y, Honda ZI, Iwama A, Suda T, Takubo K, *Honda H.

ヒストンH3の27番目のリジン残基の脱メチル化酵素KDM6A(UTX)は、全てのがんのなかでも膀胱がんで突出して遺伝子変異頻度が高く、p53変異と高頻度に合併することが知られている。我々は膀胱がんの発生母地である尿路上皮特異的に、KDM6Aを欠失させたコンディショナルノックアウトマウスを作製し、p53変異マウスと掛け合わせたKDM6A欠失・p53変異マウスを作製した。Kdm6a・p53変異マウスは尿路上皮の異形成～上皮内がんを形成したのに対し、それぞれの単独変異マウスでは異常は認められなかった。さらに発がん物質BBNを一定期間投与したところ、Kdm6a・p53変異マウスにのみ、筋層浸潤がんを認めた(上図左)。遺伝子発現解析などの結果から、Kdm6a欠失により惹起された炎症とp53変異により促進された細胞増殖が協調することにより膀胱がんが発症すること、BBNは炎症を悪化させることでがんの進行に関与することが明らかとなった。Kdm6a欠失による炎症の中心となるサイトカイン、IL6とCCL2それぞれの受容体阻害剤を併用することにより、移植したKdm6a欠失膀胱がん細胞の成長を抑制することに成功した(上図中)。実際にヒトのKDM6A欠失膀胱がんではIL6とCCL2の発現上昇と炎症の亢進がみられ(上図右)、これらの薬剤の併用療法はヒトKDM6A欠失膀胱がんに対しても治療効果が期待される。

Publication
Kdm6a Deficiency Activates Inflammatory Pathways, Promotes M2 Macrophage Polarization, and Causes Bladder Cancer in Cooperation with p53 Dysfunction.
Clin Cancer Res. 2020 Apr 15;26(8):2065-2079. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-19-2230. Epub 2020 Feb 11.
Kobatake K, Ikeda KI, Nakata Y, Yamasaki N, Ueda T, Kanai A, Sentani K, Sera Y, Hayashi T, Koizumi M, Miyakawa Y, Inaba T, Sotomaru Y, Kaminuma O, Ichinohe T, Honda ZI, Yasui W, Horie S, Black PC, Matsubara A, *Honda H.

造血器腫瘍ではヒストンメチル化の脱制御が数多く見出されており(主な研究テーマ(8))、その中でも転写を抑制する役割をもつヒストンH3の27番目のリジン残基 (H3K27)のトリメチル化修飾(H3K27me3)に我々は着目し、骨髄異形成症候群腫や関連疾患の患者検体192症例のうち6症例(3.1%)で、H3K27me3を制御するPRC2複合体の構成因子EEDに、フレームシフトによる機能欠失やアミノ酸置換を伴う変異を見出した(上図)(Pblication 1)。

この結果から我々は、正常造血と白血病発症におけるEED機能欠失の意義を検証するため、後天的誘導可能にEedの欠失を行えるコンディショナルノックアウト(cKO)マウスを作製し解析を行った。Eed cKOマウスは、ホモ欠失の場合、造血幹細胞は、細胞周期制御やニッチに対する接着機能に異常が起こり、短期間で造血細胞が消失し死亡した。一方ヘテロ欠失の場合、血液細胞に異型性や白血病発症感受性が亢進などの、骨髄異形成症候群に類似した表現型を呈した(上図左: ヘテロ欠失マウスの異型性と白血病ウィルス感染時の生存曲線)。以上から造血幹細胞の分化段階におけるEEDの遺伝子量依存的な造血器腫瘍発症機構が明らかとなった(上図右)(Publication 2)。

さらに我々は、骨髄異形成症候群と関連疾患で見出されたアミノ酸置換を伴う点突然変異、I363MをEEDに導入したノックイン(KI)マウスを作製し解析を行った。I363M変異はH3K27me3に結合する"aromatic cage" 構造の内部におこる変異である。EEDの"aromatic cage" 構造を介したH3K27me3への結合によりPRC2複合体が活性化し、H3K27me3マークが伝搬拡大していくと考えられている。実際にI363M KI ホモマウスの胎児では顕著なH3K27me3の減少が認められ、胎生致死であった。ヘテロマウスのH3K27me3は、ホモマウスと比較すると、穏やかな減少が認められ、誕生後成体まで成長した。成長したヘテロマウスは、白血病発症感受性の亢進が認められた(上図左：白血病ウィルス感染時のヘテロKIマウス生存曲線と白血病所見)。ヘテロマウスの造血幹前駆細胞はコロニー形成能と骨髄再構築能が亢進しており、PRC2複合体の標的遺伝子であるLgal3の発現抑制が解除されることで、幹細胞機能を亢進させることが明らかとなった。このような解析結果から、PRC2複合体によるH3K27me3マークの伝搬拡大にEEDの機能は必須であり、その破綻は、Lgal3の発現抑制解除による造血幹細胞の自己複製能の活性化を介して白血病発症に寄与することが示された(上図右)(Publication 3)。

Publication 1
EED mutants impair polycomb repressive complex 2 in myelodysplastic syndrome and related neoplasms.
Leukemia. 2012 Dec;26(12):2557-60. doi: 10.1038/leu.2012.146.
Ueda T, Sanada M, Matsui H, Yamasaki N, Honda ZI, Shih LY, Mori H, Inaba T, Ogawa S, *Honda H.

Publication 2
Maintenance of the functional integrity of mouse hematopoiesis by EED and promotion of leukemogenesis by EED haploinsufficiency.
Sci Rep. 2016 Jul 19;6:29454. doi: 10.1038/srep29454.
Ikeda K, Ueda T, Yamasaki N, Nakata Y, Sera Y, Nagamachi A, Miyama T, Kobayashi H, Takubo K, Kanai A, Oda H, Wolff L, Honda Z, Ichinohe T, Matsubara A, Suda T, Inaba T, *Honda H.

Publication 3
Propagation of trimethylated H3K27 regulated by polycomb protein EED is required for embryogenesis, hematopoietic maintenance, and tumor suppression.
ProcNatl Acad Sci U S A. 2016 Sep 13;113(37):10370-5. doi: 10.1073/pnas.1600070113.
Ueda T, Nakata Y, Nagamachi A, Yamasaki N, Kanai A, Sera Y, Sasaki M, Matsui H, Honda Z, Oda H, Wolff L, Inaba T, Honda H.

7q-症候群責任遺伝子として同定したSamd9Lノックアウト(KO)マウスの解析(主な研究テーマ(7))の中で、Samd9L欠失と協調して白血病発症に寄与する過剰発現遺伝子として、ヒストン脱メチル化酵素をコードするFbxl10を同定した。我々は、白血病発症におけるFbxl10過剰発現の意義を解明するため、造血幹細胞でFbxl10を過剰発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作製し解析を行った。作製したFbxl10 Tg マウスは全例で白血病を発症した(上図左：Fbxl10 Tgマウスの生存曲線と発症した白血病所見)。Tgマウスの造血幹細胞は自己複製能が活性化しており、通常神経系細胞で発現するNsg2の過剰発現と酸化的リン酸化経路の活性化によるATP量の増加が確認された。Nsg2を骨髄細胞に導入すると未成熟な細胞が増加することから、Nsg2の過剰発現によって分化障害が起こることが示唆された。さらに、クロマチン免疫沈降を用いた解析から、Fbxl10がNsg2と酸化的リン酸化経路に関わる遺伝子の制御領域に結合していることが確認された。以上の結果から、Fbxl10はその過剰発現によって、代謝経路の活性化による自己複製能の活性化とNsg2の異所的な過剰発現に起因する分化異常という2つの経路を介して、白血病発症に寄与する新規がん遺伝子であることを明らかにした(上図右)。

Publication
Fbxl10 overexpression in murine hematopoietic stem cells induces leukemia involving metabolic activation and upregulation of Nsg2. Blood. 2015 May 28;125(22):3437-46. doi: 10.1182/blood-2014-03-562694.
Ueda T, Nagamachi A, Takubo K, Yamasaki N, Matsui H, Kanai A, Nakata Y, Ikeda K, Konuma T, Oda H, Wolff L, Honda Z, Wu X, Helin K, Iwama A, Suda T, Inaba T, *Honda H.

骨髄異形成症候群や骨髄球性白血病の患者には、７番染色体のモノソミーや長腕の部分欠失(-7/7q-)などの染色大異常が高頻度に認められ、病態に関与すると考えられているがその詳細は明らかではない。我々のこれまでの研究から、7q21.3領域の責任遺伝子候補としてSAMD9とSAMD9Lを単離した。そこで我々はこれらの遺伝子欠失の造血器腫瘍発症への寄与を検討するため、Samd9L ノックアウト(KO)マウスを樹立し、解析を行った。興味深いことにSamd9L KOマウスは、ホモ欠失とヘテロ欠失同様ともに60%が老齢でヒトの-7/7q-陽性造血器腫瘍と類似した骨髄球性の疾患を発症し(上図：Smad9L欠失マウスの生存曲線と血球の異型性)、その造血幹細胞はコロニー形成能と骨髄再構築能が亢進していた。Samd9Lは初期エンドソームに局在しており、Samd9Lの欠失によって活性化したレセプターが細胞膜上に留まることが、これら表現形の分子基盤であることが示唆された。以上の結果から、Samd9Lのハプロ不全が-7/7q-陽性造血器腫瘍と類似した骨髄球性の造血器腫瘍発症に寄与し、SAMD9, SMAD9Lは-7/7q-陽性造血器腫瘍の責任遺伝子の1つである事が強く示唆される。

Publication
Haploinsufficiency of SAMD9L, an endosome fusion facilitator, causes myeloid malignancies in mice mimicking human diseases with monosomy 7.
Cancer Cell. 2013 Sep 9;24(3):305-17. doi: 10.1016/j.ccr.2013.08.011.
Nagamachi A, Matsui H, Asou H, Ozaki Y, Aki D, Kanai A, Takubo K, Suda T, Nakamura T, Wolff L,*Honda H, *Inaba T.

Cblはサイトカインシグナルのを負に制御する。慢性骨髄球性白血病（CMML）の患者において、Cblに見出された変異（Q367P）を有する遺伝子を後天的誘導可能に発現するコンディショナルノックインマウス Cbl_Q367P cKIマウスを作製し、造血器発症への寄与とその分子機構を検証した。
Cbl_Q367P cKIマウスはコントロール（Ctrl）マウスに比べ、白血球数の著増と細胞異型性がなどのCMML様の所見が認められた(上図左)。また、Cbl_Q367P cKIマウスの造血幹細胞分画ではPI3K-AKT パスウェイとJAK-STAT パスウェイの恒常的な活性化が認められ、これらのパスウェイを阻害することで骨髄球の増多が抑制されることを示した(上図右)。これらの知見はCbl変異を有するCMML患者に対する分子標的治療法開発に繋がる可能性がある。

Publication
Acquired expression of CblQ367P in mice induces dysplastic myelopoiesis mimicking chronic myelomonocytic leukemia.
Blood. 2017 Apr 13;129(15):2148-2160. doi: 10.1182/blood-2016-06-724658. Epub 2017 Feb 16
Nakata Y, Ueda T, Nagamachi A, Yamasaki N, Ikeda KI, Sera Y, Takubo K, Kanai A, Oda H, Sanada M, Ogawa S, Tsuji K, Ebihara Y, Wolff L, Honda ZI, Suda T, Inaba T, *Honda H

神経芽細胞種の特徴としてMYCNの過剰発現が知られている。神経芽細胞の患者から見出されたALK（anaplastic lymphoma kinase）の活性型変異（R1275Q）の病態への寄与を検証するため、ALK_R1275Q KI マウスを作製し、MYCN トランスジェニックマウスと掛け合わせ解析を行った。ALKR1275Q KIマウスは、MYCN Tgマウスとの掛け合わせで全例が早期に死亡し(上図左)、腹腔にアポトーシス像を伴った神経芽細胞腫を発症した(上図右)。さらにこれらの腫瘍は、MYCNトランスジェニックマウスの腫瘍と比較して、ECM(extracellular matrix)-BM(basement membrane) 関連遺伝子群の発現が低下し、浸潤能などが増強していることが明らかとなった。 我々はALK活性型変異を有する神経芽細胞種の治療法開発のため、ALK_R1275Q KI, MYCN 過剰発現マウスの発症した神経芽細胞種に対するALK阻害剤のcrizotinibの腫瘍抑制効果をアログラフトモデルで検証を行った。その結果、crizotinib の投与によって腫瘍は消失することが示された。

Publication
ALK(R1275Q) perturbs extracellular matrix, enhances cell invasion and leads to the development of neuroblastoma in cooperation with MYCN.
Oncogene. 2016 Aug 25;35(34):4447-58. doi: 10.1038/onc.2015.519. Epub 2016 Feb 1.
Ueda T, Nakata Y, Yamasaki N, Oda H, Sentani K, Kanai A, Onishi N, Ikeda K, Sera Y , Honda ZI, Tanaka K, Sata M, Ogawa S, Yasui W, Saya H, Takita J, *Honda H .

E3ユビキチンリガーゼ A20 は白血病で欠損が見られる。後天的にA20を欠失したA20 cKO マウスは肉眼で肝臓の肥大(矢頭)と脾臓に肥大(矢印)が認められた(上図左 Macro)。病理学的解析では肺(Lung)に炎症細胞の浸潤(矢印)、肝臓(Liver)に炎症細胞の浸潤(矢印)血栓(黒矢頭)、脾臓(Spleen)に白脾髄の増大(白矢頭)が認め(上図左 染色切片)、血中の炎症性サイトカインの上昇が認められた(上図右)。

Publication
Acquired deficiency of A20 results in rapid apoptosis, systemic inflammation, and abnormal hematopoietic stem cell function.
PLoS One. 2014 Jan 31;9(1):e87425. doi: 10.1371/journal.pone.0087425. eCollection 2014.
Nagamachi A, Nakata Y, Ueda T, Yamasaki N, Ebihara Y, Tsuji K, Honda Z, Takubo K, Suda T, Oda H, Inaba T, * Honda H .

Hemp KOマウス（−/−）コントロール（+/+ and +/−）に比較して胎児肝臓（FL）と胎児胸腺（FT）で細胞数の減少を認め(上図左)、また正常コントロールマウスに比較して多彩な骨格写真を認めた(上図右)。

Publication
Hemp, an mbt domain-containing protein, plays essential roles in hematopoietic stem cell function and skeletal formation.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Feb 8;108(6):2468-73. doi: 10.1073/pnas.1003403108.
*Honda H, Takubo K (These two authours contributed equally to this work), Oda H, Kosaki K, Tazaki T, Yamasaki N, Miyazaki K, Moore KA, Honda Z, Suda T, Lemischka IR.

白血病誘発ウイルスを投与したE2A/HLFコンディショナルノックインマウスはコントロールマウスに比較して早期に白血病を発症し(上図左)、ヒトE2A/HLF陽性白血病で高頻度に認めるDICによる微小血栓を認めた(上図右)。

Publication 1
Identification of Zfp521/ZNF521 as a cooperative gene for E2A-HLF to develop acute B-lineage leukemia.
Oncogene.2010 Apr 1;29(13):1963-75. doi: 10.1038/onc.2009.475.
Yamasaki N, Miyazaki K, Nagamachi A, Koller R, Oda H, Miyazaki M, Sasaki T, Honda ZI, Wolff L, Inaba T, *Honda H.

Publication 2
Oncogenic fusion E2A-HLF sensitizes t(17;19)-positive acute lymphoblastic leukemia to TRAIL-mediated apoptosis by upregulating the expression of death receptors.
Leukemia.2012 Dec;26(12):2483-93. doi: 10.1038/leu.2012.139.
Zhang X, Inukai T, Hirose K, Akahane K, Kuroda I, Honna-Oshiro H, Kagami K, Goi K, Nakamura K, Kobayashi M, Endo M, Yagita H, Kurosawa H, Thomas Look A, Honda H, Inaba T, Nakazawa S, Sugita K.

慢性骨髄性白血病を発症したp210BCR/ABLトランスジェニックマウスでは、顆粒増殖による脾臓の腫大(白三角)と顆粒球浸潤による腸管の肥厚(矢印)を認める。また、末梢血、骨髄、脾臓では分化傾向を有する顆粒球系の細胞の増殖を認める(上図左)。慢性骨髄性白血病の急性転化遺伝子として同定したZfp423について、p210BCR/ABL単独では慢性骨髄性白血病の病理像を認めるのに対し(上図右上)、p210BCR/ABLと共にZfp423を発現させると急性転化の病理像が認められた(上図右下)。

Publication 1
Overexpression/enhanced kinase activity of BCR/ABL and altered expression of Notch1 induced acute leukemia in p210BCR/ABL transgenic mice.
Oncogene. 2008 May 29;27(24):3465-74. doi: 10.1038/sj.onc.1211007.
Mizuno T, Yamasaki N, Miyazaki K, Tazaki T, Koller R, Oda H, Honda ZI, Ochi M, Wolff L, *Honda H.

Publication 2
Enhanced expression of p210BCR/ABL and aberrant expression of Zfp423/ZNF423 induce blast crisis of chronic myelogenous leukemia.
Blood. 2009 May 7;113(19):4702-10. doi: 10.1182/blood-2007-05-088724.
Miyazaki K, Yamasaki N, Oda H, Kuwata T, Kanno Y, Miyazaki M, Komeno Y, Kitaura J, Honda Z, Warming S, Jenkins NA, Copeland NG, Kitamura T, Nakamura T, *Honda H.

Publication 3
Haploinsufficiency and acquired loss of Bcl11b and H2AX induces blast crisis of chronic myelogenous leukemia in a transgenic mouse model.
Cancer Sci. 2009 Jul;100(7):1219-26. doi: 10.1111/j.1349-7006.2009.01172.x.
Nagamachi A, Yamasaki N, Miyazaki K, Oda H, Miyazaki M, Honda Z, Kominami R, Inaba T, *Honda H.

Publication 4
Crk-associated substrate lymphocyte type regulates myeloid cell motility and suppresses the progression of leukemia induced by p210Bcr/Abl.
Cancer Sci. 2011 Dec;102(12):2109-17. doi: 10.1111/j.1349-7006.2011.02066.x.
Seo S, Nakamoto T, Takeshita M, Lu J, Sato T, Suzuki T, Kamikubo Y, Ichikawa M, Noda M, Ogawa S, Honda H, Oda H, Kurokawa M. P

Publication 5
The IL-2/CD25 axis maintains distinct subsets of chronic myeloid leukemia-initiating cells.
Blood. 2014 Apr 17;123(16):2540-9. doi: 10.1182/blood-2013-07-517847.
Kobayashi CI, Takubo K, Kobayashi H, Nakamura-Ishizu A, Honda H, Kataoka K, Kumano K, Akiyama H, Sudo T, Kurokawa M, Suda T.